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氟西汀对海马神经元成长的影响

   日期:2021-07-24     来源:www.banyouapp.com    作者:未知    浏览:655    评论:0    
核心提示:氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠氟西汀是5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂之一,是应用较广的抗抑郁药。

1.4 海马细胞形态定量剖析

倒置相差显微镜(德国Zeiss公司商品)下察看加 药48 h后的海马神经元形态,每组各孔随机选择20个视线(每一个视线0.17 mm2),记录每一个视线内细胞长出突起的神经元数目,目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。

2 结 果

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1.2 大鼠海马神经元的鉴别

1.2.1 烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色

取培养6 d 6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免 疫组织化学染色。弃去培养液,4%多聚甲醛室温固定1 h ,加入 0.3% H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶,0.1% TritonX-100破膜,10%绵羊血清封闭,加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗体,4 ℃湿盒过夜,0.01 mmol ·L-1PBS清洗,加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG,放入 37 ℃温箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗,滴加SABC过氧化物酶复合物,37 ℃温箱中孵育 60 min,0.01 mmol · L-1PBS清洗,滴加 DAB显色液用途3~10 min,自来水冲洗后,常规脱水,透明封片。光镜下察看NSE表达阳性细胞。

1.2.2 尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时,取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液,0.01 mmol · L-1PBS清洗,4%多聚甲醛室温固定1 h,0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次,氯仿中1 min,95%、70%乙醇各1 min, 蒸馏水清洗,置于1%甲苯胺蓝染液中染色20 min,95%乙醇分化,在显微镜下察看控制,时间以尼氏体显示明确为准,37 ℃干燥,二甲苯透明,中性树脂封片,光学显微镜下察看。

1.3 实验分组

在培养的第3天加入氟西汀(常州第四制药厂生产),依据药物浓度不同,将实验细胞分为5组,分别加 入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常对照组加入等体 积的培养基。

2.2 海马神经元鉴别

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下察看第6 天的神经细胞,胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体 表达阳性细胞,以3个视线中阳性神经元的数目占总细胞的比率为神经元纯度,经鉴别神经元的纯度为 90%。见图2A。

2.3 氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神 经元形态学指标的影响是不一样的,10 μmol · L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比,有突起的神经元数 目增加、最长突起长度增长( P <0.05); 40 μmol · L-1 氟西汀组海马神经元与正常对照组相比,有突起神经 元数目降低( P <0.05),最长突起长度及胞体长径无 显著性差异( P >0.05);1、20 μmol · L -1 氟西汀组海马 神经元与正常对照组相比,有突起神经元数目、最长突 起长度及胞体长径无显著性差异( P >0.05)。 表1 氟西汀对加药48 h海马神经元形态学的影响(略)

1 材料与办法

1.1 新生大鼠海马神经元的离别和培养

技术办法在参考文献[2]基础上加以改进。取出生24 h内的新生SD大鼠(东南大学医学院动物实验中心提供),无菌离别出双侧海马,用显微剪剪碎,D-Hank's液清洗2或3次,将剪碎的海马组织转移至离 心管中,加入等量0.25%的胰酶(美国Sigma公司),37 ℃消化30 min,中间振摇1或2次,加入10%的 DMEM/F12(美国Gibco公司)5 ml,轻轻吹打15次,然后1 000 r · min-1离心5 min,制成单细胞悬液,置于CO2 培养箱(德国Heraeus公司商品)中,差速贴壁30min,去除成纤维细胞,吸取未贴壁的细胞,并用200目 的不锈钢滤网过滤,采集过滤后的单细胞悬液于培养皿中,然后至离心管中,取一滴单细胞悬液进行计数,并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1,然后接种于200 μg·ml-1多聚赖氨酸(美国Sigma公司)包被的6孔培养板中,转移至培养箱内培养,4 h后换为 无血清培养基,即含2% B27的Neurobasl培养基(美国Gibco公司),将来每3天半量换液1次。用培养 6 d的神经元进行染色鉴别。

2.1 海马神经元形态学察看

倒置相差显微镜下察看,培养1 d,细胞绝大多数贴壁,细胞形态大小不一,以单突起的小细胞为主。培 养6 d,神经元胞体较大,突起进一步增多、延长,并形成稀疏的互联网(图1)。培养12 d,神经元胞体进一步增 大,突起形成比较稠密的互联网。培养24 d,神经元胞体出现空泡,部分神经元死亡,胞体崩解,突触断裂。

氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠

氟西汀是5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂之一,是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁用途外,还可以治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明,氟西汀对海马的神经保护用途是其发挥抗抑郁效应的机制之 一[1]。关于氟西汀对体外培养的海马神经元成长的影响未见报道,本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元成长的影响。

1.5 统计学处置

应用SPSS12.0软件进行统计剖析,各项测试结果以x-±s 表示。多组比较及组间两两比较使用方差剖析。

 
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